CRISPR и синдром Дауна: как убрать лишнюю хромосому из клетки

CRISPR и синдром Дауна встретились в необычном эксперименте: исследователи попытались исправить не отдельную мутацию, а число целых хромосом. В выращенных в лаборатории человеческих клетках с трисомией 21 им удалось заставить часть клеток потерять одну определённую копию хромосомы 21 и перейти от трёх копий к двум. Синдром Дауна возникает, когда в клетках присутствуют три копии хромосомы 21 вместо обычных двух.

Поэтому логичная, хотя технически чрезвычайно сложная идея состоит в том, чтобы удалить именно лишнюю копию. Проблема в том, что три хромосомы 21 очень похожи друг на друга: если CRISPR будет разрезать их без разбора, можно повредить не ту копию и получить новые генетические нарушения.

Как выбрать одну хромосому из трёх

Команда Ryotaro Hashizume использовала различия в последовательности ДНК между тремя копиями хромосомы 21. Такие различия — обычные индивидуальные варианты ДНК — позволили подобрать направляющие РНК, которые преимущественно узнавали только одну выбранную копию.

Cas9 в этой системе работал не как инструмент для точечного исправления одной буквы ДНК. Исследователи заставляли его делать несколько двуцепочечных разрывов вдоль одной хромосомы. Чем больше таких разрывов они создавали, тем чаще повреждённая хромосома терялась из клетки.

В серии экспериментов использовали до 13 участков разрезания. При прямом анализе клеток методом FISH частота потери выбранной хромосомы после оптимизированного варианта с 13 разрывами достигала в среднем 17,4%. В другом эксперименте, где после обработки выращивали отдельные клеточные клоны, две копии хромосомы 21 вместо трёх были обнаружены у 22 из 72 клонов — 30,6%.

При классическом анализе метафаз нормальное число хромосом, 46 вместо 47, наблюдали в 15 из 40 метафаз. Эти проценты нельзя складывать или считать одной и той же «эффективностью»: они получены разными методами и на разных этапах эксперимента. Но вместе они подтверждают главное — выбранная копия хромосомы действительно могла исчезнуть, а две другие сохранялись.

Исследователи также временно подавляли два пути восстановления повреждённой ДНК. Это повышало вероятность того, что многократно разрезанная хромосома не будет отремонтирована, а будет потеряна клеткой. Именно здесь скрывается одновременно сила и риск метода: подход намеренно использует тот тип крупного геномного события, который в других задачах CRISPR обычно рассматривают как опасное осложнение.

Что происходило после потери хромосомы

Работу проводили прежде всего на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, полученных из кожных фибробластов ребёнка с полной трисомией 21.

Затем тот же принцип проверили и на исходных первичных фибробластах. В них после обработки частота клеток с потерей одной хромосомы 21 составила 13,9% против 1,4% в контрольной группе со случайной направляющей РНК. Авторы отдельно проверили, возможно ли такое событие в клетках, которые в данный момент не делятся.

В этой экспериментальной системе потерю хромосомы обнаружили примерно у 3,2% неделящихся клеток против 0,4% в контроле. Это важно для самой идеи будущего применения, поскольку большинство клеток взрослого организма не находятся в постоянном делении. После перехода от трисомии к двум копиям хромосомы 21 изменялся и профиль активности генов.

Клетки с исправленным кариотипом группировались отдельно от исходных трисомных клеток по данным RNA-seq; у них также немного ускорялся рост и снижалось образование активных форм кислорода. Это показывает, что удаление одной копии хромосомы меняет не только число хромосом на микрофотографии, но и свойства клетки. Но это не означает, что были «обращены вспять» проявления синдрома Дауна у человека.

Связать изменения экспрессии генов в лабораторных клетках с развитием мозга, когнитивными особенностями или состоянием целого организма по этой работе невозможно.

Почему это пока не лечение

Главное ограничение исследования — его масштаб. Авторы использовали одну линию iPS-клеток и два типа клеток, причём они происходили от одного донора. Экспериментов на животных, эмбрионах или людях не проводили.

Не решена и задача доставки такой системы CRISPR в нужные ткани организма. Есть и более фундаментальная проблема. Если Cas9 разрезает выбранную хромосому, но клетка её не теряет, разрывы могут быть отремонтированы с появлением небольших вставок, делеций и структурных перестроек.

Полное секвенирование генома также показало отдельные случаи разрезания двух других, нетаргетных копий хромосомы 21 в предназначенных для мишени участках. Авторы прямо называют защиту этих копий одной из главных задач дальнейшей работы. Кроме того, для аллель-специфического подхода необходимо знать, какие варианты ДНК принадлежат каждой из трёх хромосом, а затем подобрать подходящие направляющие.

Это делает нынешнюю схему значительно сложнее универсального лекарства. Поэтому работа не показывает, что синдром Дауна уже можно лечить редактированием генома. Она показывает нечто более узкое, но принципиально важное: в человеческих клетках можно сконструировать CRISPR-систему, которая различает три почти одинаковые копии одной хромосомы и повышает вероятность удаления выбранной из них.

Следующий вопрос гораздо труднее — можно ли когда-нибудь сделать это достаточно безопасно, воспроизводимо и адресно в живом организме.