Повреждение ДНК меняет хроматин даже после ремонта

Повреждение ДНК меняет хроматин не только на время ремонта. В клетках глиобластомы следы массовых разрывов ДНК сохранялись как минимум две недели: менялась трёхмерная укладка генома, работа генов, метилирование ДНК и химические метки на белках хроматина.

Это важное уточнение к привычной картине ремонта ДНК. Когда двойная спираль разрывается сразу в обеих цепях, клетка соединяет концы разрыва и старается восстановить целостность молекулы. Но «отремонтировано» не обязательно означает «вернулось в исходное состояние».

Сам ремонт может оставить небольшие изменения последовательности, крупные перестройки хромосом, а теперь, как показывает новая работа, ещё и более длительный след в организации хроматина.

Хроматин — это ДНК вместе с белками, которые помогают упаковать её в ядре. Эта упаковка не случайна. Участки хромосом образуют пространственные соседства и петли, благодаря которым одни гены получают доступ к регулирующим элементам, а другие оказываются менее активными. Поэтому изменение трёхмерной архитектуры генома способно менять работу клетки, даже если само изменение не является новой мутацией.

Сотни разрывов одновременно

Авторы работали со стволоподобными клетками человеческой глиобластомы. С помощью CRISPR–Cas9 они создали множество двойных разрывов ДНК в заранее определённых участках генома. Использовались две направляющие системы, рассчитанные на 142 и 483 мишени. Реальное картирование обнаружило значительно больше мест разреза — 339 и 1386 соответственно, поскольку Cas9 затрагивал и сходные последовательности.

Такой эксперимент не воспроизводит лучевую или химиотерапию буквально. Его преимущество в другом: места повреждения заранее известны, поэтому можно проследить, что происходит вокруг них через несколько часов и спустя две недели. Для сравнения авторы использовали клетки с Cas9, но без направляющей РНК.

Исследователи одновременно измеряли трёхмерные контакты между участками генома, активность генов, метилирование ДНК и ацетилирование гистонов — одну из меток, связанных с состоянием хроматина. Отдельно они искали мутации и крупные перестройки ДНК.

Через три часа изменения были заметны прежде всего в относительно локальных контактах. Участки хромосомы чаще взаимодействовали внутри своих пространственных «районов». Но через две недели картина стала другой: локальное усиление контактов ослабевало, зато становилось больше новых взаимодействий между удалёнными участками одной хромосомы и даже между разными хромосомами.

Иными словами, повреждение не просто временно нарушало упаковку ДНК вокруг места разрыва. Оно сопровождалось постепенной перестройкой пространственной организации генома.

Изменения распространялись далеко от разрыва

Эффект не ограничивался непосредственной окрестностью повреждения. Уже через три часа изменения активности генов обнаруживались на расстоянии до 20 миллионов пар оснований от ближайшего места разрыва, а часть изменений экспрессии сохранялась через две недели.

Для двух использованных систем разрезания к этому сроку устойчиво повышенной или пониженной оставалась активность 377 и 1011 генов соответственно — 30,1% и 70,8% от генов, изменивших экспрессию в соответствующих условиях.

Одновременно менялись метилирование ДНК и ацетилирование гистонов. Особенно интересно, что области генома, обычно разделённые на более активные и более закрытые пространственные компартменты, со временем начинали сильнее перемешиваться.

Авторы обнаружили и генетические последствия ремонта. Глубокое секвенирование участков вокруг разрывов выявило небольшие вставки и удаления практически во всех исследованных точках. Возникали также транслокации, инверсии, дупликации и крупные делеции. На отдельном участке частота каждого такого события обычно не превышала 5%, но крупные перестройки обнаруживались около большинства исследованных мест разрыва.

Это существенно для интерпретации результата. Работа не показывает, что последовательность ДНК везде идеально восстановилась, а затем отдельно возникла исключительно «эпигенетическая память». Генетические и негенетические изменения происходили одновременно.

Главный результат состоит в том, что последствия повреждения выходили далеко за пределы непосредственного ремонта ДНК и включали устойчивую перестройку хроматина и работы генов.

Что это может значить для опухоли

Авторы рассматривают такую перестройку как возможный механизм клеточной пластичности после сильного повреждения ДНК. Это особенно интересно для рака: лучевая терапия и многие противоопухолевые препараты действуют именно через повреждение генома. Теоретически пережившие лечение клетки могут не просто сохранить отдельные мутации, но и перейти в другое состояние регуляции генов.

Однако исследование не показало, что обнаруженные изменения действительно вызывают устойчивость глиобластомы к терапии. Оно также не доказывает, что после облучения человеческой опухоли происходит точно такая же перестройка.

Есть и другие ограничения. Разрывы создавались CRISPR–Cas9 в выбранных участках, тогда как радиация, химиотерапия и естественная геномная нестабильность повреждают ДНК гораздо более случайно. Эксперименты проводились на клеточных линиях глиобластомы, поэтому неизвестно, насколько тот же механизм выражен в других опухолях или нормальных клетках.

Наконец, наблюдение продолжалось две недели — достаточно, чтобы говорить об устойчивом эффекте, но недостаточно, чтобы называть его постоянным.

Работа меняет сам вопрос о последствиях повреждения ДНК. Важно не только то, удалось ли клетке снова соединить разорванную молекулу и какие мутации появились при ремонте. После сильного повреждения может измениться ещё и пространственная организация генома — а вместе с ней программа работы клетки.