CAR-T-клетки внутри организма: точное редактирование ДНК

CAR-T-клетки внутри организма удалось создать с помощью точного редактирования ДНК, не извлекая человеческие иммунные клетки для перепрограммирования в лаборатории. В экспериментах на гуманизированных мышах полученные таким способом клетки уничтожали опухоли, включая лейкоз, множественную миелому и саркому.

Результаты опубликованы в журнале Nature. Но главное достижение исследователей заключается не только в противоопухолевом эффекте. Им удалось встроить крупную генетическую конструкцию в заранее выбранный участок генома Т-лимфоцитов непосредственно внутри живого организма.

Для клеточной терапии это принципиально новый уровень контроля.

Почему CAR-T-терапию приходится изготавливать для каждого пациента

CAR-T-терапия использует собственные Т-лимфоциты человека, которым добавляют искусственный рецептор для распознавания определённых клеток. Такой рецептор называют химерным антигенным рецептором, или CAR.

Например, рецептор против белка CD19 позволяет модифицированному Т-лимфоциту находить и уничтожать клетки некоторых видов лейкоза и лимфомы.

Существующая технология требует сложного производства. У пациента забирают Т-лимфоциты, доставляют их в специализированную лабораторию, генетически модифицируют, размножают и только затем вводят обратно.

На это уходят недели. Процесс дорогостоящий, а качество конечного клеточного препарата может зависеть от состояния исходных клеток пациента.

Создание CAR-T-клеток непосредственно в организме рассматривается как способ обойти часть этих ограничений. Подобные подходы уже разрабатывались, но у них есть серьёзные технические проблемы.

Одни методы доставляют в клетки информационную РНК. Рецептор появляется лишь временно, поскольку РНК постепенно разрушается.

Другие используют вирусные переносчики, способные надолго встроить генетическую конструкцию в ДНК клетки. Но место встраивания может быть случайным. Кроме того, существует опасность изменения не тех клеток, на которые рассчитана терапия.

Авторы новой работы попытались одновременно решить обе задачи: доставить ген именно Т-лимфоцитам и встроить его в определённое место генома.

Две частицы и один точный адрес в ДНК

Исследователи разработали систему, в которой две разные частицы доставляют в клетку отдельные компоненты генетического редактирования.

Первая представляет собой оболочечную частицу, несущую белок Cas9 вместе с направляющей РНК. Она позволяет разрезать ДНК в выбранном участке.

Вторая создана на основе аденоассоциированного вируса. Она доставляет ДНК-конструкцию с геном CAR и последовательностями, необходимыми для его встраивания.

В качестве адреса выбран участок TRAC — генетическая область, связанная с образованием обычного Т-клеточного рецептора.

Это особенно важно. Исследователи использовали конструкцию без собственного промотора. После правильного встраивания ген CAR начинает работать под управлением естественного регуляторного участка TRAC, активного в Т-лимфоцитах.

Таким образом, система не просто добавляет клетке новый рецептор. Она стремится обеспечить его устойчивое и предсказуемое образование именно в нужном клеточном окружении.

Чтобы обе частицы эффективнее попадали в Т-лимфоциты, авторы дополнительно модифицировали их поверхность.

Частицу с Cas9 снабдили фрагментом антитела, распознающим CD3 на Т-клетках. Это одновременно помогает адресной доставке и активирует клетки, повышая вероятность успешного встраивания ДНК.

Для доставки генетической конструкции разработали вариант аденоассоциированного вируса AAV-hT7. Его получили путём отбора вариантов вирусной оболочки с улучшенным проникновением в человеческие Т-лимфоциты. Одним из важных факторов этого проникновения оказался поверхностный белок CD7.

В результате два отдельных переносчика выполняют разные задачи, но должны встретиться в одной клетке.

От точного редактирования до уничтожения опухоли

Сначала систему проверили на человеческих Т-лимфоцитах в лабораторных условиях, а затем на мышах с пересаженными человеческими иммунными клетками.

В оптимизированном варианте эксперимента доля Т-лимфоцитов с интегрированной конструкцией CAR достигала 19,7% среди Т-клеток селезёнки через 14 дней после введения переносчиков.

Этого оказалось достаточно для выраженного биологического эффекта. В модели с рецептором против CD19 у обработанных животных наблюдалось полное исчезновение обнаруживаемых В-лимфоцитов — клеток, несущих эту мишень.

Затем исследователи перешли к опухолевым моделям.

При остром В-клеточном лимфобластном лейкозе полный ответ на лечение наблюдался у 18 из 20 мышей в экспериментах с человеческими иммунными клетками от четырёх доноров.

В модели множественной миеломы полный ответ получили у всех восьми обработанных животных. Когда части мышей повторно ввели опухолевые клетки, у трёх из четырёх сохранялся контроль над опухолью.

Подход испытали и против солидной опухоли — саркомы. Для этого использовали CAR, распознающий другой поверхностный белок, B7-H3.

В экспериментах с клетками двух доноров полные ответы зарегистрировали у пяти из шести и трёх из восьми мышей соответственно.

Получается, что одна платформа доставки могла создавать внутри организма Т-клетки с разными противоопухолевыми рецепторами.

Авторы также сравнили свою систему с методом, при котором CAR вводят непосредственно в организме с помощью лентивирусных переносчиков. В изученной модели лейкоза точное встраивание в TRAC обеспечивало более быстрое размножение модифицированных Т-клеток и более однородную экспрессию рецептора.

Это согласуется с предположением исследователей, что место расположения нового гена влияет на эффективность CAR-T-клеток. Но однозначно приписывать весь противоопухолевый эффект только точному встраиванию пока нельзя.

Что ещё предстоит проверить

Все противоопухолевые эксперименты проводились на мышах с пересаженными человеческими клетками, а не на пациентах.

Причём животные имели выраженный иммунодефицит. Такая модель позволяет изучать работу человеческих Т-лимфоцитов, но не полностью воспроизводит иммунные реакции человека.

В частности, остаются вопросы о нежелательных изменениях генома, длительной безопасности, распределении переносчиков по тканям и реакции иммунной системы на введённые частицы.

Авторы не обнаружили признаков системного воспалительного ответа при исследованных сроках наблюдения, но этого недостаточно, чтобы считать метод безопасным для человека.

Ещё одна проблема — антитела к вирусному переносчику. Хотя AAV-hT7 лучше переносил воздействие уже существующих нейтрализующих факторов, после введения организм может сформировать новые антитела, осложняющие повторное применение.

Наконец, исчезновение В-лимфоцитов в модели с CD19 служит доказательством функциональной активности созданных CAR-T-клеток, но в клинической практике подобное истощение нормальных В-клеток может быть нежелательным последствием терапии.

Сегодня CAR-T-терапия во многом остаётся индивидуальным производственным процессом: клетки одного человека отправляют на модификацию, а затем возвращают ему.

В этой работе исследователи показали другой принцип. Генетическую программу можно доставить к человеческим Т-лимфоцитам внутри организма, встроить в заранее выбранную область ДНК и получить клетки, способные атаковать опухоль.

Именно возможность управлять не только тем, какой ген попадёт в клетку, но и тем, где он окажется в её геноме, отличает эту технологию от многих предшествующих подходов.