Cas12a2 против раковых клеток: мутация запускает разрушение ДНК

Cas12a2 против раковых клеток в этой работе действует совсем не так, как привычный CRISPR-редактор. Вместо исправления мутации система использует мутантную РНК как сигнал: распознав её, Cas12a2 активируется и начинает повреждать хроматин — ДНК, упакованную внутри ядра. Для клетки это оборачивается множественными повреждениями генома, остановкой деления и гибелью.

Такой подход особенно интересен для мутаций, которые трудно атаковать обычными лекарствами. Один из главных примеров — TP53, ген белка p53, изменённого примерно в 40–50% случаев рака. Многие мутантные формы p53 не имеют удобного участка, к которому могла бы прочно присоединиться небольшая лекарственная молекула.

Авторы работы в Nature предложили не пытаться чинить такой белок, а использовать РНК с опухолевой мутацией как своеобразный опознавательный знак клетки.

Как мутация превращается в спусковой крючок

Cas12a2 относится к семейству CRISPR-белков, но заметно отличается от более известного Cas9. Направляющая РНК помогает ему найти определённую молекулу РНК. После распознавания нужной последовательности Cas12a2 переходит в активное состояние и начинает разрезать другие нуклеиновые кислоты поблизости.

В природе такая активность входит в систему защиты бактерий от инфекции. Здесь её использовали иначе: вместо точечного редактирования генома активированный Cas12a2 намеренно наносит клетке масштабные повреждения.

В биохимических экспериментах фермент разрушал не только свободную ДНК, но и хроматин. В клетках млекопитающих его активация сопровождалась признаками острого повреждения ДНК, включением клеточного ответа на генотоксический стресс, остановкой клеточного цикла и гибелью.

Главная идея состоит в том, чтобы включать эту разрушительную активность только там, где присутствует характерная для опухоли РНК.

Один из наиболее наглядных экспериментов провели на клетках немелкоклеточного рака лёгкого PC9. Они несут делецию EGFR E746_A750del: из последовательности удалены 15 нуклеотидов, поэтому в РНК появляется новая граница между участками, которой нет в нормальном EGFR.

Направляющую РНК настроили именно на эту границу. В клетках с мутантным EGFR система вызывала выраженное подавление роста и повреждение ДНК, тогда как клетки с обычной версией EGFR были значительно менее чувствительны.

Различить одну изменённую букву

Ещё более сложная задача — отличить мутантную РНК от нормальной, если они различаются всего одним нуклеотидом. Авторы проверили несколько точечных мутаций TP53, включая R248Q и R280K. Для некоторых вариантов направляющие удалось подобрать так, чтобы Cas12a2 значительно сильнее активировался в присутствии мутантного транскрипта.

Особенно важно, что эффект наблюдали не только с искусственно добавленной мишенью. Клетки PC9 естественным образом несут мутацию TP53 R248Q. Нацеливание Cas12a2 на соответствующую РНК подавляло рост этих клеток, вызывало признаки повреждения ДНК и увеличивало долю погибающих клеток.

У метода, однако, есть молекулярные ограничения. Cas12a2 не одинаково хорошо распознаёт любые последовательности: рядом с мишенью должен находиться подходящий участок РНК, называемый PFS. Кроме того, результат зависит от того, сколько целевой РНК производится в клетке. Поэтому далеко не каждая опухолевая мутация автоматически подходит для такой стратегии.

Что получилось у мышей

Для экспериментов in vivo исследователи упаковали матричную РНК, кодирующую Cas12a2, вместе с направляющей РНК в липидные наночастицы.

Подход проверили в нескольких доклинических моделях. В модели рака печени, связанного с высокой активностью MYC, лечение системой, нацеленной на РНК MYC, уменьшало опухолевое поражение печени по сравнению с контрольными вариантами.

В другой серии экспериментов иммунодефицитным мышам вводили клетки PC9, образующие опухоли в лёгких. Когда лечение начинали на раннем этапе — через пять дней после введения 200 000 опухолевых клеток — шесть введений наночастиц с направляющей против TP53 R248Q замедляли прогрессирование опухоли.

Более тяжёлая модель показала пределы метода. Если мышам вводили миллион опухолевых клеток и начинали лечение только через 21 день, существующая опухолевая нагрузка в лёгких уже не уменьшалась, хотя появление метастатического заболевания задерживалось.

Серьёзной проблемой остаётся и доставка. В отдельном эксперименте после одной дозы липидных наночастиц доставленная РНК обнаруживалась лишь примерно в 7–18% опухолевых клеток PC9 в лёгких.

Поэтому речь пока не идёт о новом лечении рака у людей. Это доклиническая демонстрация принципа на клетках и мышах. Необходимо понять, насколько безопасно можно доставлять такую систему в опухоли человека, насколько надёжно она различит мутантную и нормальную РНК и что произойдёт при ошибочной активации Cas12a2 в здоровой клетке.

Но сама стратегия необычна. Если мутантный белок трудно заблокировать и ещё труднее восстановить, его РНК можно превратить в адрес опухолевой клетки. Мутация в таком случае становится не только причиной или признаком болезни, но и сигналом, запускающим разрушение клетки, которая её несёт.