CRISPR-активация при лимфоме выявила новый путь устойчивости

CRISPR-активация при лимфоме позволила посмотреть на лекарственную устойчивость с необычной стороны. Вместо того чтобы по очереди выключать гены и искать слабые места опухоли, исследователи сделали почти противоположное: систематически усиливали работу генов и наблюдали, какие из них помогают раковым клеткам пережить лечение.

Так обнаружился неожиданный кандидат — ген Irx5. Его активация сделала клетки мышиной модели агрессивной лимфомы устойчивее к венетоклаксу, препарату, который блокирует белок BCL-2 и тем самым должен облегчать запуск запрограммированной гибели клетки. При включении Irx5 опухолевые клетки повышали уровень другого белка, поддерживающего выживание, и получали обходной путь вокруг заблокированного BCL-2.

Это был лишь один из результатов более крупной работы, опубликованной в Science Advances. Её главная цель — создать инструмент, способный искать не только гены, без которых клетка погибает, но и гены, усиление которых меняет её поведение.

Вместо выключения генов — их включение

Классические CRISPR-скрининги часто работают по принципу потери функции: определённый ген повреждают, а затем смотрят, что изменилось. Такой подход хорошо отвечает на вопрос: «Без чего клетка не может обойтись?»

Но многие свойства опухоли возникают по другой причине. Ген не исчезает, а начинает работать слишком активно. Например, повышенная экспрессия белка может ускорить рост опухоли или дать ей возможность пережить лекарство. Обычный скрининг с выключением генов такую ситуацию моделирует плохо.

Для этого существует CRISPR-активация, или CRISPRa. В этой системе белок Cas9 используют не как молекулярные «ножницы», а как средство доставки активирующего комплекса к началу нужного гена. Последовательность ДНК не требуется разрезать: задача состоит в том, чтобы заставить собственный ген клетки работать сильнее.

Авторы создали мышиную полногеномную библиотеку CRISPRa под названием Partita. Для каждой точки начала транскрипции они предусмотрели по 10 направляющих РНК, а всю библиотеку разделили на пять подбиблиотек. Такая избыточность повышает вероятность того, что хотя бы несколько направляющих действительно эффективно активируют выбранный ген.

В экспериментах использовали объединённые библиотеки: в большой популяции клеток разные направляющие включали разные гены, а затем исследователи смотрели, какие варианты становились чаще или, наоборот, исчезали. Это позволяет одновременно проверять тысячи потенциальных изменений.

Как клетка обошла венетоклакс

Одним из испытаний Partita стал поиск причин лекарственной устойчивости в мышиной модели так называемой double-hit-лимфомы — агрессивной опухоли с высокой активностью MYC и BCL-2. Авторы провели полногеномные скрининги устойчивости к трём препаратам, запускающим или усиливающим гибель опухолевых клеток: венетоклаксу, нутлину-3a и этопозиду.

Логика проста. Если после воздействия лекарства клетки с определённой активированной генетической программой выживают лучше остальных, соответствующие направляющие РНК накапливаются в популяции. Так можно найти гены, способные дать клетке преимущество под давлением терапии.

Среди результатов были как ожидаемые участники известных путей выживания, так и менее очевидные кандидаты. Особенно выделился Irx5 — ген, кодирующий регулятор транскрипции. Его повышенная активность защищала клетки от венетоклакса.

Это важно из-за самого принципа действия препарата. Венетоклакс блокирует BCL-2 — белок, который помогает некоторым раковым клеткам не запускать программу самоуничтожения. Но клеточная система выживания не состоит из одного переключателя. Усиление Irx5 позволяло повысить уровень другого защитного белка и тем самым частично изменить зависимость клетки от BCL-2.

Иными словами, устойчивость может возникать не только из-за изменения самой мишени лекарства. Опухолевая клетка способна перестроить систему, расположенную вокруг этой мишени.

Гены, которые ускорили лимфому в организме

Затем исследователи перенесли скрининг из клеточной культуры в живую модель. В мышах они искали гены, активация которых ускоряет развитие MYC-зависимой лимфомы.

В числе наиболее заметных кандидатов оказались Runx2, Runx3 и Csf1r. Когда эти гены активировались, соответствующие опухолевые клоны получали преимущество и быстрее участвовали в развитии заболевания. Это показывает ещё одно применение Partita: библиотека может искать не только механизмы устойчивости к лекарствам, но и изменения, которые сами по себе усиливают опухолевый процесс.

Работа не показывает, что IRX5, RUNX2, RUNX3 или CSF1R уже являются готовыми мишенями для лечения пациентов. Большая часть экспериментов выполнена на мышиных клетках и моделях, а искусственная CRISPR-активация может создавать уровни экспрессии, отличающиеся от возникающих в человеческих опухолях естественным образом. Для каждого кандидата ещё предстоит определить, насколько часто тот же механизм работает при заболевании человека.

Но эта работа добавляет функциональной геномике важное измерение. Скрининги с выключением генов спрашивают, без чего опухоль не способна существовать. Partita позволяет задать другой вопрос: что достаточно включить, чтобы опухоль росла быстрее или пережила лекарство.