Как LINE-1 вызывает перестройки хромосом

LINE-1 вызывает перестройки хромосом, когда незавершённые копии этого мобильного элемента соединяются с разрывами ДНК или друг с другом. В клеточных экспериментах такие промежуточные молекулы сводили вместе участки генома, которые обычно находятся далеко, создавая транслокации, инверсии и крупные делеции. LINE-1 — это мобильный генетический элемент, способный копировать себя и вставлять новую копию в другое место генома.

Его последовательности занимают около 17% человеческой ДНК, хотя у конкретного человека лишь примерно 150 полноразмерных копий потенциально сохраняют способность перемещаться. В большинстве обычных клеток они подавлены, но во многих опухолях LINE-1 вновь становится активным.

Незавершённая вставка превращается в опасный конец ДНК

LINE-1 перемещается не как готовый фрагмент ДНК. Сначала он создаёт РНК-копию, а затем белок ORF2p разрезает хромосомную ДНК и прямо в месте разреза синтезирует по этой РНК новую ДНК-копию.

Обычно процесс заканчивается вставкой LINE-1 в геном. Однако промежуточная копия может остаться незавершённой. Тогда рядом существуют свободный конец хромосомы и ещё не встроенная ДНК LINE-1.

Авторы работы предположили, что такая конструкция способна вступить в ошибочную рекомбинацию — соединиться с другим разрывом хромосомы вместо завершения обычной вставки. Чтобы увидеть редкие события, исследователи создали систему из двух неполных частей гена зелёного флуоресцентного белка GFP. Одну часть переносил LINE-1, вторую разместили рядом с разрывом, который создавали с помощью Cas9.

Клетка начинала светиться зелёным только тогда, когда промежуточная копия LINE-1 соединялась с разорванной хромосомой и восстанавливала целый ген GFP. Эксперименты провели в культивируемых человеческих клетках U2OS и HEK293. Затем зелёные клетки исследовали с помощью длинночтительного секвенирования Oxford Nanopore, позволяющего прочитать через всю точку перестройки и определить, какие участки хромосом оказались соединены.

В первой системе авторы подробно расшифровали шесть перестроек: пять транслокаций между разными хромосомами и одну инверсию внутри хромосомы 11. В местах соединения сохранялись характерные признаки работы LINE-1 — обработанная РНК-последовательность, поли-А-хвост и следы разреза, сделанного ORF2p. Это подтвердило, что перестройки возникли через промежуточную ДНК-копию LINE-1, а не из-за случайного соединения экспериментальных плазмид.

Две незавершённые копии могут встретиться друг с другом

Во второй системе обе половины GFP переносились двумя разными молекулами LINE-1.

Зелёный сигнал появлялся, когда две одновременно формирующиеся ДНК-копии соединялись между собой. Если элементы запускали последовательно, сигнал не возникал. Значит, рекомбинировали именно незавершённые промежуточные продукты, а не уже встроенные копии.

Длинные чтения выявили среди таких событий сегментные делеции и транслокации, включая перестройку, способную образовать нестабильную хромосому с двумя центромерами. В совокупности авторы обнаружили 12 связанных с LINE-1 перестроек и 75 обычных вставок в клетках U2OS, а также 6 перестроек и 17 вставок в HEK293. Эти числа нельзя считать естественной частотой событий: эксперимент был специально построен так, чтобы находить редкие перестройки.

Важным условием оказалась похожесть соединяемых последовательностей. Когда общую область сократили со 150 до 50 пар оснований, рекомбинация промежуточной копии с разрывом хромосомы происходила примерно в четыре раза реже. При полном отсутствии совпадающей последовательности эта репортёрная система сигнала не давала.

Для соединения двух копий LINE-1 эффективно работало совпадение длиной не менее 25 пар оснований; 6 пар или отсутствие совпадения были недостаточны.

Системы ремонта ДНК играют двойную роль

Особенно показательной оказалась роль BRCA1. Этот белок обычно помогает сохранять стабильность генома и одновременно ограничивает обычные вставки LINE-1. Но в созданной системе BRCA1 был нужен для перестроек, основанных на длинных одинаковых участках.

Когда его количество снижали, стандартных вставок LINE-1 становилось больше, а гомологичных перестроек — меньше. Вероятно, BRCA1 помогает подготовить и сопоставить похожие концы ДНК, которые затем могут соединиться неправильным образом. Другой защитный белок, MSH2, действовал как контролёр точности.

Всего три несовпадения в общей области длиной 150 пар оснований заметно уменьшали рекомбинацию. При подавлении MSH2 соединение таких несовпадающих копий возрастало примерно в 1,8 раза. Иными словами, система исправления ошибок не давала достаточно различающимся повторяющимся последовательностям легко «склеиваться» друг с другом.

Работа не показывает, как часто этот механизм действует в организме человека или в конкретной опухоли. Использовались клеточные линии, искусственно усиленная активность LINE-1, специально созданные разрывы и репортёры, отбирающие преимущественно перестройки с общей последовательностью. Более простые соединения без выраженной гомологии, вероятно, встречаются чаще, но эта система их почти не видит.

Тем не менее исследование даёт прямую механистическую модель того, как активный мобильный элемент может не просто добавить новую копию в геном, а физически связать удалённые разрывы и изменить архитектуру хромосом. Это помогает объяснить часть сложных перестроек, наблюдаемых в геномах опухолей, и указывает на возможные риски технологий редактирования генома, использующих инженерные ретротранспозоны.